丙酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒 微量法

貨號：BC0385

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：110mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：1mL×1支，-20℃避光保存；

試劑三：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×1支，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加入1mL蒸餾水；

試劑七：粉劑×1支，4℃保存；

工作液的配制：臨用前把試劑四、五、0.5mL六、七轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解待用。

產(chǎn)品說明：

     PDH（EC 4.1.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成羥乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。

    PDH催化丙酮酸脫氫，同時還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導(dǎo)致605nm光吸收的減少。

需自備的儀器和用品

    可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、PDH的提取

    準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨，4 ℃ 11000 g離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟

• 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長605nm，蒸餾水調(diào)零。
• 每個樣本需要180μL工作液，按樣本數(shù)取出一定量的工作液置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min。
• 空白管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL水，混勻，立即記錄605nm處初始吸光值A(chǔ)1和 1min后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA_空白=A1-A2。
• 測定管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL樣本，混勻，立即記錄605nm處初始吸光值A(chǔ)3和 1min后的吸光值A(chǔ)4，計算ΔA_測定=A3-A4。
•  

三、PDH活性計算

a.用微量比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T

=904.762×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/g 鮮重）＝[(ΔA測定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=913.81×(ΔA測定-ΔA空白)÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/10⁴ cell）＝[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500)÷T=1.828×(ΔA測定-ΔA空白)

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.9×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T

=1809.524×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/g 鮮重）＝[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=1827.62×(ΔA測定-ΔA空白)÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。

PDH活性（U/10⁴ cell）＝[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T=3.655×(ΔA測定-ΔA空白)

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.9×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，21×10³mol/L/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

注意事項：

1、測定過程中所有樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2、測定管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測定管的ΔA值大于0.25，需將樣本進行稀釋。

 相關(guān)文獻：

《Rare ginsenosides ameliorate lipid overload-induced myocardial insulin resistance via modulating metabolic flexibility.》 作者:Shuang Peng,Yilei Wang,Ying Zhou,Tingting Ma,Yapu Wang,Jia Li,Fang Huang,Junping Kou,Lianwen Qi,Baolin Liu,Kang Liu 期刊:Phytomedicine 影響因子:4.18 PMID:31005715
 

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